自身抗體檢測問題及對策

自身抗體(autoantibody)是指針對自身組織、器官、細胞、細胞亞結(jié)構(gòu)、體內(nèi)蛋白分子等所有自身抗原的抗體總稱，其本質(zhì)為機體B細胞分泌的免疫球蛋白。自身抗體分為生理性自身抗體(或稱天然自身抗體)和病理性自身抗體，后者即為通常講的自身抗體。據(jù)報道，目前發(fā)現(xiàn)的自身抗體達數(shù)百種，目前臨床常規(guī)檢測自身抗體項目約80種，主要包括抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)及其抗體譜、抗中性粒細胞胞漿抗體(antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)及其抗體譜、抗磷脂抗體譜、自身免疫肝病抗體譜及肌炎抗體譜等。近年來，隨著抗體篩選技術(shù)的應(yīng)用，越來越多的自身抗體被發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用范圍除自身免疫性疾病外，已拓展至消化、生殖及腫瘤等領(lǐng)域。自身抗體檢測種類及數(shù)量爆發(fā)式增長，自身抗體檢測市場欣欣向榮，但同時也帶來不少問題，現(xiàn)對自身抗體檢測的問題和對策作一探討。
                                                                                             

自身抗體相關(guān)概念 

自身抗體相關(guān)概念問題包括自身抗體命名及其檢測方法兩個方面。 

1．自身抗體命名：

自身抗體命名并無專門機構(gòu)統(tǒng)一管理，而由各學(xué)者自由發(fā)揮，如對于傳統(tǒng)的抗SSA抗體，其本質(zhì)為干燥綜合征(sj?gren syndrome，SS)患者發(fā)現(xiàn)的第一個抗體。隨著抗原重組純化技術(shù)的發(fā)展，可檢測到抗SSA抗體的兩個亞單位，即抗SSA/Ro60抗體和抗SSA/Ro52抗體，兩種抗體與SS的關(guān)系如何？臨床出具的報告為抗SSA抗體，其具體指那種？這給臨床醫(yī)生造成極大的困惑，實際上傳統(tǒng)的抗SSA抗體即指抗Ro60抗體，而抗Ro52抗體與SS沒有太大關(guān)系。再如，ANA譜及ENA抗體譜的概念問題，ANA譜是指針對明確純化抗原抗體的集合，其與傳統(tǒng)的ENA抗體譜有所不同，傳統(tǒng)ENA抗體譜檢測通常采用磷酸鹽緩沖液提取動物胸腺細胞核蛋白作為抗原底物。但由于核成分中的DNA和組蛋白等堿性成分無法被磷酸鹽緩沖液(pH＝7.2)提取，因此，傳統(tǒng)ENA抗體譜并未包括抗DNA和抗組蛋白抗體。而目前，仍有很多學(xué)術(shù)文章、專著及檢驗報告等均會出現(xiàn)兩者概念混淆的情況。對于這種問題應(yīng)由專業(yè)學(xué)術(shù)委員會及時對易造成困惑的問題進行澄清和宣講，以提高學(xué)術(shù)界的統(tǒng)一認識。還有，目前臨床上檢測的ANCA，由于雜志社或出版社的要求，將"胞漿"統(tǒng)一為"胞質(zhì)"，因此，該抗體具有抗中性粒細胞胞漿抗體和抗中性粒細胞胞質(zhì)抗體兩種命名，這種命名差異也給臨床醫(yī)生和研究學(xué)者造成混亂，部分學(xué)者仍在質(zhì)疑這兩個抗體是否為同一種物質(zhì)。對于這種命名修改應(yīng)做一定的調(diào)查，以大家統(tǒng)一的認知度為準，然后再確定是否需要修改。

2．自身抗體檢測方法命名：

自身抗體檢測方法越來越多，近年來出現(xiàn)了流式熒光法和化學(xué)發(fā)光法等新型檢測方法。不可否認，試劑生產(chǎn)商推廣的檢測方法和產(chǎn)品將帶動自身抗體學(xué)科的發(fā)展。但在一定條件下，出現(xiàn)了試劑生產(chǎn)商引領(lǐng)學(xué)科發(fā)展，有時對學(xué)科造成很大混亂，如：流式熒光法、懸浮芯片法、multiplex法、液相芯片技術(shù)、多元流式點陣儀等，其實質(zhì)這些方法大同小異；另外如免疫印跡法、線性印跡法或免疫斑點法等，這些方法也是相同的，由于專家學(xué)術(shù)認知不同，這些大同小異的方法卻按不同方法寫入了專著或教材，其負面影響更深遠。行業(yè)協(xié)會及出版社應(yīng)該為此負起審核責(zé)任，避免學(xué)術(shù)混亂。

自身抗體標準溯源 

自身抗體必須采用相應(yīng)的靶抗原進行免疫結(jié)合反應(yīng)進行檢測，即抗體針對的靶抗原才是核心，因此自身抗體檢測結(jié)果與靶抗原的序列、肽段三級或四級結(jié)構(gòu)，抗原決定簇暴露位置等有關(guān)。不同抗原生產(chǎn)商靶抗原結(jié)構(gòu)會有一定的差異，特別是對于專利保護的抗原，試劑生產(chǎn)商為了避開專利，對抗原進行重新設(shè)計和改造，合成新的抗原，若該抗原決定簇與其他抗原不同或不完全相同，就會造成檢測結(jié)果不相符。如，抗心磷脂抗體檢測對于狼瘡和病態(tài)妊娠的診斷具有重要價值，但同一患者不同醫(yī)院檢測結(jié)果迥異，臨床醫(yī)生不知該如何處理。此外，由于很多試劑生產(chǎn)商購買第三方的抗原原料進行包被加工，出于商業(yè)秘密原因，很多試劑廠商不會告知抗原來源或抗原序列，這為真正的結(jié)果判斷帶來障礙。對于活細胞的標準化溯源更為困難，臨床上推薦采用HEp-2細胞底物進行ANA檢測，由于細胞固定前是培養(yǎng)的活細胞株，對于同一批號的活細胞存在不同生長周期的細胞，因此，同一底物片中的細胞各不相同。而對于不同試劑生產(chǎn)商而言，其細胞差別會更大，更何況有些細胞進行了改造，如將HEp-2細胞中導(dǎo)入SSA抗原，以增強檢測抗SSA抗體的能力，這種細胞稱為HEp-2000細胞，其與傳統(tǒng)的HEp-2細胞具有較大差別。

目前，自身抗體檢測無溯源標準是行業(yè)共認的難題。目前國內(nèi)僅有抗甲狀腺球蛋白抗體等少數(shù)自身抗體能購買到相關(guān)的標準品，國外學(xué)者也認識到自身抗體檢測標準化問題，已有Diana等學(xué)者對抗促甲狀腺受體抗體進行標準化比對研究，以盡量實現(xiàn)結(jié)果可比性。但對于大多數(shù)抗體并無標準品可以參考，目前我國臨床上通常采用市場占有率高及信譽度高的試劑作為標準，但實際上，上述標準未必是真正的標準，甚至可能誤導(dǎo)臨床，比較合適的方法應(yīng)該是以臨床診斷患者為標準，以較高的臨床診斷靈敏度和特異性作為試劑評判標準可能是一種目前不得以而求其次的辦法。

自身抗體檢測方法選擇 

目前，自身抗體檢測方法多，主要以熒光法、印跡法及ELISA法為主。以ANA檢測為例，HEp-2細胞為底物的間接免疫熒光法是推薦檢測方法，但并非所謂的"金標準"方法。而ANA譜通常采用以純化抗原的免疫印跡法或ELISA法進行檢測。有很多文獻認為前者為篩選性實驗，而后者為確證性實驗，實際上這種說法欠妥。既然間接免疫熒光法檢測ANA是篩選性實驗，那該方法應(yīng)將所有相關(guān)抗體全部檢測出來，但實際并非如此，熒光法ANA為陰性但ANA譜[如抗Ro60抗體和(或)抗Jo-1抗體等]可出現(xiàn)陽性，更不能以熒光法檢測ANA陰性，即認為ANA譜必為陰性，截至目前也有不少論文表明ANA和ANA譜同時檢測的必要性。此外，將ANA譜稱為確診性實驗也不妥，確診性實驗的含義是指該實驗方法能將標本中的抗體檢測出來并一定會檢測出來，但鑒于抗原結(jié)合位點及檢測敏感度的問題，任何人都無法保證能將真正的抗體全部檢測出來，因此，在臨床上避免使用這兩個容易引起誤解的詞匯。

目前自身抗體檢測多為定性或半定量的方法，定量高敏的檢測方法是自身抗體發(fā)展的方向。對于目前出現(xiàn)的兩種檢測方法，即多個自身抗體同時檢測(也可單個檢測)的流式熒光法和單項自身抗體檢測的化學(xué)發(fā)光法該如何選擇？兩種檢測方法均為高精度、全自動化大型檢測儀器，但其各具特點，前者一次檢測項目多達100多項，但其必須組套項目同時檢測，對于初診患者而言，確實可以通過多個疾病的自身抗體組套，可以很快檢測出相關(guān)疾病的自身抗體，當然其檢測費用較高，但可以節(jié)約診斷時間；對于確診患者，通常只需要檢測曾經(jīng)檢測出的陽性的幾個自身抗體即可，這對于流式熒光法而言，多項檢測將造成資源浪費。因此，試劑儀器生產(chǎn)商將會對檢測技術(shù)及檢測成本進行競爭，讓臨床能夠得到更多更好的選擇。

自身抗體檢測的標準化 

準確的結(jié)果不僅取決于臨床檢驗過程，與試劑生產(chǎn)過程也密切相關(guān)。嚴格來講，自身抗體檢測的標準化包括試劑生產(chǎn)、標本檢測及報告審核等全過程。但由于試劑生產(chǎn)和臨床檢測由不同部門監(jiān)管，因此，此處只討論實驗室檢測的標準化。所謂標準化，即對相關(guān)操作要求均有嚴格的規(guī)定，但對自身抗體的臨床檢測，其標準化要求顯得比較寬容，但這對于臨床檢測卻是很大的問題。

1．滴度系統(tǒng)：

目前部分自身抗體檢測結(jié)果采用滴度高低表示，滴度越高表明患者體內(nèi)自身抗體濃度越高。以ANA檢測為例，目前采用以HEp-2細胞為底物的間接免疫熒光法進行檢測，但血清起始稀釋度卻各不相同，如1∶80或1∶100等，而且國內(nèi)有兩種滴度體系，即倍比滴度體系(1∶80、1∶160、1∶320、1∶640…)和 度體系(1∶100、1∶320、1∶1 000、1∶3 200…)，同一患者在不同醫(yī)院檢測由于滴度系統(tǒng)不同，結(jié)果無法對應(yīng)，臨床醫(yī)生如何判斷自身抗體濃度趨勢？當然患者可以在同一家醫(yī)院進行復(fù)診監(jiān)測，但若轉(zhuǎn)診到ANA滴度系統(tǒng)不同的醫(yī)院就必須重新檢測。對于這一問題，行業(yè)協(xié)會和行政管理部門已經(jīng)關(guān)注并制定專家共識，目前允許兩種滴度系統(tǒng)共存。但從長遠的角度而言，統(tǒng)一起始稀釋度和滴度系統(tǒng)，通過不同試劑對比找到各自滴度的對應(yīng)平衡點，為結(jié)果統(tǒng)一和報告互認打下基礎(chǔ)，可為國家節(jié)約大量的醫(yī)保經(jīng)費。

2．反應(yīng)溫度：

溫度是影響免疫學(xué)反應(yīng)的重要因素。不同的溫度將會導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)較大的差異。很多實驗室采用手工檢測進行自身抗體檢測，即使采用儀器，反應(yīng)環(huán)境也是裸露于室溫當中。目前很多試劑盒說明書均要求在"室溫"條件下反應(yīng)，這種彈性要求給自身抗體檢測埋下隱患。在實際情況下室溫變化很大，不同地區(qū)間的室溫差別更大，對于這一問題，應(yīng)從幾個方面解決，首先，試劑說明書應(yīng)規(guī)定在確定的溫度下進行，但對于裸露的試劑和儀器具體具有挑戰(zhàn)性，要求維持房間恒溫可能不現(xiàn)實，比較可行的方法是實驗室可以進行不同溫度下的ANA結(jié)果差異研究，從而調(diào)整不同溫度時的溫育時間，通過性能驗證找到溫度差異及時間差異的平衡點，從而制定適合自身條件變化的標準化操作規(guī)程(standard operating procedure，SOP)，嚴格遵循SOP進行日常操作，以減小因溫度差異造成的結(jié)果差異。

3．反應(yīng)時間：

時間是影響免疫學(xué)反應(yīng)的另一重要因素。臨床實踐中，很多實驗室對于反應(yīng)時間這一要求的執(zhí)行并不嚴格。以ANA檢測為例，若采用手工加樣檢測，加樣第一點及最后一點反應(yīng)時間本身已有差別，第一點反應(yīng)時間等于最后一點反應(yīng)時間加上加樣持續(xù)時間，對于加樣較慢的技術(shù)人員，這種影響其實并不小。因此，對于檢測儀器而言，需要設(shè)計采取每反應(yīng)區(qū)均有相同的反應(yīng)時間，保證每反應(yīng)區(qū)的反應(yīng)條件的均一性。這種反應(yīng)時間執(zhí)行不嚴格還表現(xiàn)在補加熒光標記抗體上。在臨床實踐中，偶然會出現(xiàn)熒光標記抗體側(cè)漏到反應(yīng)區(qū)外的情況，對于這種情況，很多實驗室只是將熒光標記抗體補上去而已，對于熒光標記抗體孵育時間減少了多少并未關(guān)注，這將會導(dǎo)致自身抗體滴度下降甚至假陰性。對于這一問題，嚴格以"非立即補加須進行復(fù)查"的原則，以保證檢測結(jié)果質(zhì)量。

4．熒光模型判讀：

熒光法檢測自身抗體包括底物片檢測和熒光模型判讀兩個過程。檢測結(jié)果受方法、試劑、儀器及實驗人員的經(jīng)驗等諸多因素影響外，熒光判讀過程的影響其實更大，影響因素包括熒光顯微鏡的質(zhì)量，技術(shù)人員對圖像的認知經(jīng)驗，熒光強度的感知，視力的好壞等。目前已有公司開始采用熒光圖像采集，然后通過觀察顯示器上圖像進行結(jié)果判讀，這也帶來新的問題，如各公司圖像采集卡的質(zhì)量和參數(shù)不同，顯示器分辨率及顯卡質(zhì)量等存在很大差異，同一圖像在不同條件下可以得出完全不同的結(jié)果，這一點值得我們注意。對于上述問題，應(yīng)分兩個階段解決，第一階段，由于各家實驗室的熒光顯微鏡、圖像采集卡、顯示器及讀片人員均有所不同，之間的差異會比較大，行業(yè)協(xié)會可以采用發(fā)放不同熒光模型不同滴度梯度的血清作為結(jié)果校準標準，以此為標準制作各實驗室條件下的熒光圖像模型及滴度標準，這樣可以消除硬件及人為主觀因素之間的差異，最后實現(xiàn)同一血清無論那家實驗室檢測結(jié)果均在相同的滴度區(qū)間，當然熒光模型越多越全越好。

自身抗體項目選擇及應(yīng)用 

近年來，自身抗體檢測的進展迅速，抗體種類繁多，應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴大。但臨床應(yīng)用過程中，自身抗體項目選擇及應(yīng)用存在一些問題。對于大部分自身抗體而言，對于疾病診斷敏感度不高，即不是所有患者都能檢測到相應(yīng)的自身抗體；特異度也不好，即不是所有陽性抗體均能且只能診斷某一種疾病。很多自身抗體的應(yīng)用共識是：只有患者懷疑某種疾病時才檢測相應(yīng)的自身抗體，陽性結(jié)果對于疾病診斷具有輔助診斷價值，陰性結(jié)果則不能排除診斷。臨床實踐中，商家將太多的自身抗體組合在一起，特別是線性免疫印跡條帶，一人份試劑條可以組套20多個不同的自身抗體項目，很多情況下，這種組套對于患者而言并不是每個指標都有價值，從而浪費大量的醫(yī)療資源，實際上，在一定程度上是試劑規(guī)格和項目組合綁架了醫(yī)保制度。對于這一問題，試劑廠商應(yīng)盡量將檢驗項目單獨分裝，若需要組套也應(yīng)以疾病相關(guān)抗體組合在一起，組合項目越少越好。這種作法，對于實驗室檢測而言可能會增加一定工作量，但從國家整體而言，可以節(jié)約大量的醫(yī)保經(jīng)費支出。

   展望 

目前，自身抗體檢測存在諸多問題，包括試劑生產(chǎn)商、儀器供應(yīng)商、檢測人員技術(shù)及認識、檢測管理制度等多個方面。有些問題是表面的，而有些問題是深層次的。解決這些問題應(yīng)經(jīng)過兩個階段。首先是問題認識階段，由于不少人員對自身抗體檢測的問題認識不足，在加強認識的基礎(chǔ)上集眾人之智慧，在實際工作過程中盡量避免可以避免的問題；其次是問題解決階段，需對上述問題全面考慮、逐個解決。國家行政管理部門、國家標準化委員會及行業(yè)協(xié)會統(tǒng)一組織管理，從試劑準入、儀器審核、制度規(guī)定、標準制訂、技術(shù)要求上頂層設(shè)計、統(tǒng)一布署，從根本上高效地解決自身抗體檢測存在的問題，使自身抗體檢測結(jié)果具有精確度更高、可比性更強，檢驗人員更有信心，為自身抗體檢測結(jié)果互認打下基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)自：中華醫(yī)學(xué)網(wǎng)