動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

第一節(jié)  大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用簡(jiǎn)介

通過大規(guī)模體外培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)哺乳類動(dòng)物細(xì)胞是生產(chǎn)生物制品的有效方法。20世界60-70年代，就已創(chuàng)立了可用于大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的微載體培養(yǎng)系統(tǒng)和中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。近十?dāng)?shù)年來，由于人類對(duì)生長(zhǎng)激素、干擾素、單克隆抗體、疫苗及白細(xì)胞介素等生物制品的需求猛增，以傳統(tǒng)的生物化學(xué)技術(shù)從動(dòng)物組織獲取生物制品已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足這一需求。隨著細(xì)胞培養(yǎng)的原理與方法日臻完善，動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)趨于成熟。

所謂動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)（large-scale culture technology）是指在人工條件下（設(shè)定ph、溫度、溶氧等），在細(xì)胞生物反應(yīng)器（bioreactor）中高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。目前可大規(guī)模培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞有雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細(xì)胞及人二倍體細(xì)胞、cho（中華倉(cāng)鼠卵巢）細(xì)胞、BHK-21(倉(cāng)鼠腎細(xì)胞)、Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎傳代細(xì)胞，是貼壁依賴的成纖維細(xì)胞)等，并已成功生產(chǎn)了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、紅細(xì)胞生成素、單克隆抗體等產(chǎn)品。

在過去幾十年來，該技術(shù)經(jīng)有了很大發(fā)展，從使用轉(zhuǎn)瓶(roller bottle) 、CellCube等貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)展為生物反應(yīng)器（Bioreactor）進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)。第一代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)核心問題是難以產(chǎn)業(yè)化或者說是規(guī)?；a(chǎn)：一是在工藝生產(chǎn)時(shí)不能大規(guī)模制備產(chǎn)品；二是非批量生產(chǎn)容易導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量的不均一性；三是難以對(duì)同批生產(chǎn)進(jìn)行生產(chǎn)和質(zhì)量控制。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，迫切需要大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)，特別是培養(yǎng)表達(dá)特異性蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以便獲得大量有用的細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物。采用玻璃瓶靜置或旋轉(zhuǎn)瓶的培養(yǎng)方法，已不能滿足所需細(xì)胞數(shù)量及其分泌產(chǎn)物。因而必須為工業(yè)化生產(chǎn)開創(chuàng)一種新的技術(shù)方法。自70年代以來，細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器有很大的發(fā)展，種類越來越多，規(guī)模越來越大，較常見的細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器有空氣提升反應(yīng)器，中空纖維管反應(yīng)器，無泡攪拌反應(yīng)器及籃式生物反應(yīng)器等。八十年代以來，人們逐漸開始以生物反應(yīng)器培養(yǎng)代替鼠腹水的方法獲得單克隆抗體。

動(dòng)物細(xì)胞是一種無細(xì)胞壁的真核細(xì)胞，生長(zhǎng)緩慢，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境十分敏感。采用傳統(tǒng)的生物化工技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)，除了要滿足培養(yǎng)過程必需的營(yíng)養(yǎng)要求外，有必要建立合理的控制模型，進(jìn)行pH和溶氧（DO）的最佳控制。細(xì)胞生物反應(yīng)器可通過微機(jī)有序地定量地控制加入動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐內(nèi)的空氣、氧氣、氮?dú)夂投趸妓姆N氣體的流量，使其保持最佳的比例來控制細(xì)胞培養(yǎng)液中的pH值和溶氧水平，使系統(tǒng)始終處于最佳狀態(tài)，以滿足動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)對(duì)pH值和溶解氧的需要。如為提高或達(dá)到一定的溶氧水平可改變通入培養(yǎng)罐內(nèi)氣體中氧氣和氮?dú)獾谋壤齺韺?shí)現(xiàn)控制DO值的目的。采用二氧化碳/碳酸氫鈉（CO2/NaHCO3）緩沖液系統(tǒng)來控制培養(yǎng)液的pH值是一種較好的方法。

現(xiàn)在，由于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在規(guī)模和可靠性方面都不斷發(fā)展，且從中得到的蛋白質(zhì)也被證明是安全有效的，因此人們對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的態(tài)度已經(jīng)發(fā)生了改變。許多人用和獸用的重要蛋白質(zhì)藥物和疫苗，尤其是那些相對(duì)較大、較復(fù)雜或糖基化（glycosylated）的蛋白質(zhì)來說，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是首選的生產(chǎn)方式。60年代初，英國(guó)AVRI研究所在貼壁細(xì)胞系BHK21中將口蹄疫病毒培養(yǎng)成功后，從最初的200ml和800ml玻璃容器開始，很快就放大到30L和100L不銹鋼罐的培養(yǎng)規(guī)模。使用的是基于Eagle's配方的培養(yǎng)基，補(bǔ)充5%成年牛血清和蛋白胨。1967年以后，Wellcome（現(xiàn)為Cooper動(dòng)物保?。┘瘓F(tuán)分布于歐洲、非洲和南美洲8個(gè)國(guó)家的生產(chǎn)廠商，應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)口蹄疫疫苗和獸用狂犬疫苗，已掌握了5000L的細(xì)胞罐大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。

目前已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的產(chǎn)品有：口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰瘡病毒疫苗、巨細(xì)胞病毒疫苗、α及β干擾素、血纖維蛋白溶酶原激活劑、凝血因子Ⅷ和Ⅸ、促紅細(xì)胞素、松弛素、生長(zhǎng)激素、蛋白C、免疫球蛋白、尿激酶、激肽釋放酶及200種單克隆抗體等。其中，口蹄疫疫苗是動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法生產(chǎn)的主要產(chǎn)品之一。1983年，英國(guó)Wellcome公司就已能夠利用動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)口蹄疫疫苗。美國(guó)Genentech公司應(yīng)用SV40為載體，將乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行高效表達(dá)，已生產(chǎn)出乙型肝炎疫苗。英國(guó)Wellcome公司采用8000L Namalwa細(xì)胞生產(chǎn)α干擾素。英國(guó)Celltech公司用氣升式生物反應(yīng)器生α、β和γ干擾素；用無血清培養(yǎng)液在10000L氣升式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。美國(guó)Endotronic公司用中空纖維生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)出免疫球蛋白G、A、M和尿激酶、人生長(zhǎng)激素等。

第二節(jié) 大規(guī)模培養(yǎng)常用方法

根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞的類型，可采用貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)等三種培養(yǎng)方法進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。

一、動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)特性及培養(yǎng)溫度

1.細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素
2.細(xì)胞大，無細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，環(huán)境適應(yīng)性差
3.需氧少，不耐受強(qiáng)力通風(fēng)與攪拌
4.群體生長(zhǎng)效應(yīng)，貼壁生長(zhǎng)（錨地依賴性）
5.培養(yǎng)過程產(chǎn)品分布細(xì)胞內(nèi)外，成本高
6.原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡

依據(jù)在體外培養(yǎng)時(shí)對(duì)生長(zhǎng)基質(zhì)依賴性差異，動(dòng)物細(xì)胞可分為兩類：

●貼壁依賴型細(xì)胞：需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面才能生長(zhǎng)，大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞，包括非淋巴組織細(xì)胞和許多異倍體細(xì)胞均屬于這一類。

●非貼壁依賴型細(xì)胞：無需附著于固相表面即可生長(zhǎng)，包括血液、淋巴組織細(xì)胞、許多腫瘤細(xì)胞及某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
培養(yǎng)細(xì)胞的最適溫度相當(dāng)于各種細(xì)胞或組織取材機(jī)體的正常溫度。人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的最適溫度為35~37℃。偏離這一溫度，細(xì)胞正常的代謝和生長(zhǎng)將會(huì)受到影響，甚至死亡?？偟膩碚f，培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)低溫的耐力比高溫高。溫度不超過39℃時(shí)，細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度成正比；細(xì)胞培養(yǎng)置于39~40℃環(huán)境中1h，即受到一定損傷，但仍能恢復(fù)；當(dāng)溫度達(dá)43℃以上時(shí)，許多細(xì)胞將死亡。當(dāng)溫度下降到30~20℃時(shí)，細(xì)胞代謝降低，因而與培養(yǎng)基之間物質(zhì)交換減少。首先看到的是細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變以及細(xì)胞從基質(zhì)上脫落下來。當(dāng)培養(yǎng)物恢復(fù)到初始的培養(yǎng)溫度時(shí)，它們?cè)械男螒B(tài)和代謝也隨之恢復(fù)到原有水平。

二、貼壁培養(yǎng)（attachment culture）是指細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)。

1.生長(zhǎng)特性：貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細(xì)胞單層。

2.貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：
●容易更換培養(yǎng)液；細(xì)胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。
●容易采用灌注培養(yǎng)，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的目的；因細(xì)胞固定表面，不需過濾系統(tǒng)。
●當(dāng)細(xì)胞貼壁于生長(zhǎng)基質(zhì)時(shí)，很多細(xì)胞將更有效的表達(dá)一種產(chǎn)品。
●同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液/細(xì)胞的比例。
●適用于所有類型細(xì)胞。

3.貼壁培養(yǎng)的缺點(diǎn)：與懸浮培養(yǎng)法相比
●擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資大；
●占地面積大；
●不能有效監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)；

4.細(xì)胞貼壁的表面：要求具有凈陽電荷和高度表面活性。對(duì)微載體而言還要求具一定電荷密度；若為有機(jī)物表面，必須具有親水性，并帶陽電荷。

5.貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)：主要有轉(zhuǎn)瓶、中空纖維（后面專題介紹）、玻璃珠、微載體系統(tǒng)（后面介紹）等。

●轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)：培養(yǎng)貼壁依賴型細(xì)胞最初采用轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)一般用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過渡階段，或作為生物反應(yīng)器接種細(xì)胞準(zhǔn)備的一條途徑。細(xì)胞接種在旋轉(zhuǎn)的圓筒形培養(yǎng)器-轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)瓶不斷旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣，從而提供較好的傳質(zhì)和傳熱條件。

轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，投資少，技術(shù)成熟，重復(fù)性好，放大只需簡(jiǎn)單的增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量等優(yōu)點(diǎn)。

但也有其缺點(diǎn)：勞動(dòng)強(qiáng)度大，占地空間大，單位體積提供細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積小，細(xì)胞生長(zhǎng)密度低，培養(yǎng)時(shí)監(jiān)測(cè)和控制環(huán)境條件受到限制等。

現(xiàn)在使用的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)包括二氧化碳培養(yǎng)箱和轉(zhuǎn)瓶機(jī)兩類。

●反應(yīng)器貼壁培養(yǎng) 此種培養(yǎng)方式中，細(xì)胞貼附于固定的表面生長(zhǎng)，不因?yàn)閿嚢瓒S培養(yǎng)液一起流動(dòng)，因此比較容易更換培養(yǎng)液，不需要特殊的分離細(xì)胞和培養(yǎng)液的設(shè)備，可以采用灌流培養(yǎng)獲得高細(xì)胞密度，能有效地獲得一種產(chǎn)品；但擴(kuò)大規(guī)模較難，不能直接監(jiān)控細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，故多用于制備用量較小、價(jià)值高的生物藥品。

CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反應(yīng)器是常用的貼壁培養(yǎng)式生物反應(yīng)器，用于細(xì)胞貼壁培養(yǎng)時(shí)可用籃式攪拌系統(tǒng)和圓盤狀載體。此載體是直徑6毫米無紡聚酯纖維圓片，具很高表面積與體積比（1200cm2/g），利于獲得高細(xì)胞密度?；@式攪拌系統(tǒng)和載體培養(yǎng)是目前貼壁細(xì)胞培養(yǎng)使用最多方式，用于雜交瘤細(xì)胞、Hela細(xì)胞、293細(xì)胞、CHO細(xì)胞及其它細(xì)胞培養(yǎng)。此種方式培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞接種后貼壁快。

三、懸浮培養(yǎng)（suspension culture）：是指細(xì)胞在反應(yīng)器中自由懸浮生長(zhǎng)的過程。主要用于非貼壁依賴型細(xì)胞培養(yǎng)，如雜交瘤細(xì)胞等；是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)通起來的。

無血清懸浮培養(yǎng)是用已知人源或動(dòng)物來源的蛋白或激素代替動(dòng)物血清的一種細(xì)胞培養(yǎng)方式，它能減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，正逐漸成為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的研究新方向。

四、固定化培養(yǎng)（immobilization culture）：是將動(dòng)物細(xì)胞與水不溶性載體結(jié)合起來，再進(jìn)行培養(yǎng)。上述兩大類細(xì)胞都適用，具有細(xì)胞生長(zhǎng)密度高，抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞易于產(chǎn)物分開，有利于產(chǎn)物分離純化。制備方法很多，包括吸附法、共價(jià)貼附法、離子/共價(jià)交聯(lián)法、包埋法、微囊法等。

1.吸附法:用固體吸附劑將細(xì)胞吸附在其表面而使細(xì)胞固定化的方法稱為吸附法（adhesion）。操作操簡(jiǎn)便、條件溫和、是動(dòng)物細(xì)胞固定化中較早研究使用的方法。缺點(diǎn)是：載體的負(fù)荷能力低，細(xì)胞易脫落。微載體培養(yǎng)和中空纖維培養(yǎng)是該方法的代表，稍后專門介紹。

2.共價(jià)貼附法:利用共價(jià)鍵將動(dòng)物細(xì)胞與固相載體結(jié)合的固定化方法稱為共價(jià)貼附法（attachment by covalent bonding）。此法可減少細(xì)胞的泄漏，但須引入化學(xué)試劑，對(duì)細(xì)胞活性有影響，且因貼附而導(dǎo)致擴(kuò)散限制小，細(xì)胞得不到保護(hù)。

3. 離子/共價(jià)交聯(lián)法:雙功能試劑處理細(xì)胞懸浮液，會(huì)在細(xì)胞間形成橋而絮結(jié)產(chǎn)生交交聯(lián)作用，此固定化細(xì)胞方法稱為離子/共價(jià)交聯(lián)法（cross-linking by covalent bonding）。交聯(lián)試劑會(huì)使一些細(xì)胞死亡，也會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)散限制。

4.包埋法:將細(xì)胞包埋在多孔載體內(nèi)部制成固定化細(xì)胞的方法稱為包埋法（entrapment）。優(yōu)點(diǎn)是：步驟簡(jiǎn)便、條件溫和、負(fù)荷量大、細(xì)胞泄漏少，抗機(jī)械剪切。缺點(diǎn)是：擴(kuò)散限制，并非所有細(xì)胞都處于最佳基質(zhì)濃度，且大分子基質(zhì)不能滲透到高聚物網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部。一般適用于非貼壁依賴型細(xì)胞的固定化，常用載體為多孔凝膠，如瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白。

5.微囊法（microencapsulation）:是用一層親水的半透膜將細(xì)胞包圍在珠狀的微囊里，細(xì)胞不能逸出，但小分子物質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可自由出入半透膜；囊內(nèi)是種微小培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似，能保護(hù)細(xì)胞少受損傷，故細(xì)胞生長(zhǎng)好、密度高。微囊直徑控制在200-400μm為宜。制備中應(yīng)注意：

●溫和、快速、不損傷細(xì)胞，盡量在液體和生理?xiàng)l件下操作；
●所用試劑和膜材料對(duì)細(xì)胞無毒害；
●膜的孔徑可控制，必須使?fàn)I養(yǎng)物和代謝物自由通過；
●膜應(yīng)有足夠機(jī)械強(qiáng)度抵抗培養(yǎng)中攪拌。

五、抗凋亡策略在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中的應(yīng)用

生物反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)過程中，細(xì)胞凋亡在細(xì)胞死亡中占主要部分。研究顯示在大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器中細(xì)胞的死亡中80%是凋亡所導(dǎo)致,而不是以前所認(rèn)為的壞死。而在大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞死亡是維持細(xì)胞高活性和高密度的障礙。理論上講，防止或延長(zhǎng)細(xì)胞死亡，可以極大提高生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白的產(chǎn)量。

細(xì)胞凋亡由一系列基因精確地調(diào)控，是多細(xì)胞生物發(fā)育和維持穩(wěn)態(tài)所必需的生理現(xiàn)象。已知凋亡的最終執(zhí)行者是Caspase家族，它們均為半胱氨酸蛋白酶，各識(shí)別一個(gè)4氨基酸序列，并在識(shí)別序列C端天冬氨酸殘基處將底物切斷。Caspase含有可被自身識(shí)別的序列，可以切割活化自身而導(dǎo)致信號(hào)放大，并作用于下游Caspase成員，從而形成Caspase家族的級(jí)聯(lián)放大，最終作用于效應(yīng)蛋白，引起細(xì)胞凋亡。

所以在大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)干擾細(xì)胞在培養(yǎng)中凋亡的發(fā)生，提高細(xì)胞特異性抵制遇到壓力而引起凋亡的能力，有利于提高細(xì)胞的培養(yǎng)密度、延長(zhǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)周期，從而提高目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量2-3倍。

1.營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)抗凋亡
在常規(guī)生物反應(yīng)器構(gòu)造中，營(yíng)養(yǎng)耗竭或缺乏培養(yǎng)基中特殊的生長(zhǎng)因子則引起凋亡，例如血清，糖或特殊氨基酸的耗盡。培養(yǎng)基中添加氨基酸或其它關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)可抑制凋亡、延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間從而提高產(chǎn)品的生產(chǎn)。大規(guī)模培養(yǎng)中細(xì)胞凋亡主要由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗竭或代謝產(chǎn)物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補(bǔ)加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)凋亡。另外，動(dòng)物細(xì)胞在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。

2.基因抗凋亡
與凋亡相關(guān)的一系列基因產(chǎn)物可對(duì)其進(jìn)行正、負(fù)向的調(diào)控，因此可通過導(dǎo)入相應(yīng)基因來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。Bcl-2基因是目前 有效的抗凋亡基因，在多種細(xì)胞系中均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗凋亡活性。

3.化學(xué)方法抗凋亡
凋亡發(fā)生時(shí)細(xì)胞許多部位發(fā)生生化物質(zhì)的改變，有些變化如改變細(xì)胞氧化還原條件產(chǎn)生活性氧在凋亡信號(hào)階段發(fā)生，其它的如破壞線粒體膜電位、激活caspase則發(fā)生在凋亡效應(yīng)階段，這在絕大多數(shù)細(xì)胞死亡中是相同的。因此,阻止這些生化物質(zhì)的改變可能阻止或至少延遲細(xì)胞凋亡的發(fā)生，運(yùn)用化學(xué)物質(zhì)可抑制信號(hào)效應(yīng)階段的發(fā)生，被認(rèn)為是抗調(diào)亡策略之一。
大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式

深層培養(yǎng)可分為：分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式、連續(xù)式和灌注式五種。

一、分批式培養(yǎng)（batch culture） 是細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)發(fā)展進(jìn)程中較早期采用的方式，也是其它操作方式的基礎(chǔ)。該方式采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，一次性轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中其體積不變，不添加其它成分，待細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成積累到適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，一次性收獲細(xì)胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基的操作方式。

該方式的特點(diǎn):
●操作簡(jiǎn)單。培養(yǎng)周期短，染菌和細(xì)胞突變的風(fēng)險(xiǎn)小。反應(yīng)器系統(tǒng)屬于封閉式，培養(yǎng)過程中與外部環(huán)境沒有物料交換，除了控制溫度、pH值和通氣外，不進(jìn)行其他任何控制，因此操作簡(jiǎn)單，容易掌握；
●直觀反映細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的過程。因培養(yǎng)期間細(xì)胞生長(zhǎng)代謝是在一個(gè)相對(duì)固定的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，不添加任何營(yíng)養(yǎng)成分,因此可直觀的反映細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的過程,是動(dòng)物細(xì)胞工藝基礎(chǔ)條件或"小試"研究常用的手段；
●可直接放大。由于培養(yǎng)過程工藝簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備和控制的要求較低，設(shè)備的通用性強(qiáng)，反應(yīng)器參數(shù)的放大原理和過程控制，比較其它培養(yǎng)系統(tǒng)較易理解和掌握，在工業(yè)化生產(chǎn)中分批式培養(yǎng)操作是傳統(tǒng)的、常用的方法，其工業(yè)反應(yīng)器(Genetech)規(guī)?？蛇_(dá)12000L。

分批培養(yǎng)過程中，細(xì)胞的生長(zhǎng)分為五個(gè)階段：延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期，見圖1。分批培養(yǎng)的周期時(shí)間多在3-5天，細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞先經(jīng)歷對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（48-72h）細(xì)胞密度達(dá)到最高值后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗劫或代謝毒副產(chǎn)物的累積細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期進(jìn)而死亡，表現(xiàn)出典型的生長(zhǎng)周期。收獲產(chǎn)物通常是在細(xì)胞快要死亡前或已經(jīng)死亡后進(jìn)行。

二、流加式培養(yǎng)（feeding culture）

1.流加式培養(yǎng)是在批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或以懸浮微載體培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，細(xì)胞初始接種的培養(yǎng)基體積一般為終體積的1/2～1/3，在培養(yǎng)過程中根據(jù)細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)物或培養(yǎng)基，從而使細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)至較高的密度，目標(biāo)產(chǎn)品達(dá)到較高的水平，整個(gè)培養(yǎng)過程沒有流出或回收，通常在細(xì)胞進(jìn)入衰亡期或衰亡期后進(jìn)行終止回收整個(gè)反應(yīng)體系，分離細(xì)胞和細(xì)胞碎片，濃縮、純化目標(biāo)蛋白。

2.流加培養(yǎng)特點(diǎn)：
●流加培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速率、營(yíng)養(yǎng)物消耗和代謝產(chǎn)物抑制情況，流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。流加的速率與消耗的速率相同，按底物濃度控制相應(yīng)的流加過程，保證合理的培養(yǎng)環(huán)境與較低的代謝產(chǎn)物抑制水平。
●培養(yǎng)過程以低稀釋率流加，細(xì)胞在培養(yǎng)系統(tǒng)中停留時(shí)間較長(zhǎng)，總細(xì)胞密度較高，產(chǎn)物濃度較高。
●流加培養(yǎng)過程須掌握細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，能量代謝動(dòng)力學(xué)，研究細(xì)胞環(huán)境變化時(shí)的瞬間行為。流加培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)和培養(yǎng)條件與環(huán)境優(yōu)化，是整個(gè)培養(yǎng)工藝中的主要內(nèi)容。
●在工業(yè)化生產(chǎn)，懸浮流加培養(yǎng)工藝參數(shù)的放大原理和過程控制，比較其它培養(yǎng)系統(tǒng)較易理解和掌握，可采用工藝參數(shù)的直接放大。

流加培養(yǎng)是當(dāng)前動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中占有主流優(yōu)勢(shì)的培養(yǎng)工藝，也是近年來動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)研究的熱點(diǎn)。流加培養(yǎng)中的關(guān)鍵技術(shù)是基礎(chǔ)培養(yǎng)基和流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。通常進(jìn)行流加的時(shí)間多在指數(shù)生長(zhǎng)后期，細(xì)胞在進(jìn)入衰退期之前，添加高濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。可以添加一次，也可添加多次，為了追求更高的細(xì)胞密度往往需要添加一次以上，直至細(xì)胞密度不再提高；可進(jìn)行脈沖式添加，也可以降低的速率緩慢進(jìn)行添加，但為了盡可能的維持相對(duì)穩(wěn)定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)環(huán)境，后者采用較多；添加的成分比較多，凡是促細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)均可以進(jìn)行添加。流加的總體原則是維持細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，營(yíng)養(yǎng)成分即不過剩而產(chǎn)生大量的代謝副產(chǎn)物造成營(yíng)養(yǎng)利用效率下降而成為無效的利用；也不缺乏導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制或死亡。

3.流加工藝中的營(yíng)養(yǎng)成分主要分為三大類：

●葡萄糖：葡萄糖是細(xì)胞的供能物質(zhì)和主要的碳源物質(zhì)，然而當(dāng)其濃度較高是會(huì)產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物乳酸，因而需要進(jìn)行其濃度控制，以足夠維持細(xì)胞生長(zhǎng)而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳。
●谷氨酰胺：谷氨酰胺是細(xì)胞的供能物質(zhì)和主要的氮源物質(zhì)，然而當(dāng)其濃度較高是會(huì)產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物氨，因而也需要進(jìn)行其濃度控制，以足夠維持細(xì)胞生長(zhǎng)而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳；
大規(guī)模培養(yǎng)中細(xì)胞凋亡主要由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗竭或代謝產(chǎn)物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補(bǔ)加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)凋亡。另外，動(dòng)物細(xì)胞在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。
●氨基酸、維生素及其他：主要包括營(yíng)養(yǎng)必需氨基酸、營(yíng)養(yǎng)非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羥脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸絲氨酸；此外還包括其他營(yíng)養(yǎng)成分如膽堿、生長(zhǎng)刺激因子。添加的氨基酸形式多為左旋氨基酸，因而多以鹽或前體的形式替代單分子氨基酸，或者添加四肽或短肽的形式。在進(jìn)行添加時(shí)，不溶性氨基酸如胱氨酸、酪氨酸和色氨酸只在中性pH值部分溶解，可采用泥漿的形式進(jìn)行脈沖式添加；其他的可溶性氨基酸以溶液的形式用蠕動(dòng)泵進(jìn)行緩慢連續(xù)流加。
4.流加式培養(yǎng)分為兩種類型：?jiǎn)我谎a(bǔ)料分批式培養(yǎng)和反復(fù)補(bǔ)料分批式培養(yǎng)。
●單一補(bǔ)料分批式培養(yǎng)是在培養(yǎng)開始時(shí)投入一定量的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，培養(yǎng)到一定時(shí)期，開始連續(xù)補(bǔ)加濃縮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，直到培養(yǎng)液體積達(dá)到生物反應(yīng)器的最大操作容積，停止補(bǔ)加，最后將細(xì)胞培養(yǎng)液一次全部放出。該操作方式受到反應(yīng)器操作容積的限制，培養(yǎng)周期只能控制在較短的時(shí)間內(nèi)。
●反復(fù)補(bǔ)料分批式培養(yǎng)是在單一補(bǔ)料分批式操作的基礎(chǔ)上，每個(gè)一定時(shí)間按一定比例放出一部分培養(yǎng)液，是培養(yǎng)液體積始終不超過反應(yīng)器的最大操作容積，從而在理論上可以延長(zhǎng)培養(yǎng)周期，直至培養(yǎng)效率下降，才將培養(yǎng)液全部放出。

三、半連續(xù)式培養(yǎng)（semi-continuous culture）

1.半連續(xù)式培養(yǎng)又稱為重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)形式。在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時(shí)間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補(bǔ)足到原有體積，使反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變。

這種類型的操作是將細(xì)胞接種一定體積的培養(yǎng)基，讓其生長(zhǎng)至一定的密度，在細(xì)胞生長(zhǎng)至最大密度之前，用新鮮的培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物，每次稀釋反應(yīng)器培養(yǎng)體積的1/2~3/4，以維持細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)，隨著稀釋率的增加培養(yǎng)體積逐步增加?；蛘咴诩?xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過程中，每隔一定時(shí)間，定期取出部分培養(yǎng)物，或是條件培養(yǎng)基，或是連同細(xì)胞、載體一起取出，然后補(bǔ)加細(xì)胞或載體，或是新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)的一種操作模式。剩余的培養(yǎng)物可作為種子，繼續(xù)培養(yǎng)，從而可維持反復(fù)培養(yǎng)，而無需反應(yīng)器的清洗、消毒等一系列復(fù)雜的操作。在半連續(xù)式操作中由于細(xì)胞適應(yīng)了生物反應(yīng)器的培養(yǎng)環(huán)境和相當(dāng)高的接種量，經(jīng)過幾次的稀釋、換液培養(yǎng)過程，細(xì)胞密度常常會(huì)提高。

2.半連續(xù)式特點(diǎn)：
●培養(yǎng)物的體積逐步增加；
●可進(jìn)行多次收獲；
●細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長(zhǎng)，并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在一較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)到很長(zhǎng)時(shí)間。
該操作方式的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)效率高，可長(zhǎng)時(shí)期進(jìn)行生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品，可使細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。

四、連續(xù)式培養(yǎng)（continuous culture）

1.連續(xù)式培養(yǎng)是一種常見的懸浮培養(yǎng)模式，采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)。該模式是將細(xì)胞接種與一定體積的培養(yǎng)基后，為了防止衰退期的出現(xiàn)，在細(xì)胞達(dá)最大密度之前，以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基；同時(shí)，含有細(xì)胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。理論上講，該過程可無限延續(xù)下去。

2.連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達(dá)到恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長(zhǎng)。穩(wěn)定狀態(tài)可有效的延長(zhǎng)分批培養(yǎng)中的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在穩(wěn)定狀態(tài)下細(xì)胞所處的環(huán)境條件如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、pH值可保持恒定，細(xì)胞濃度以及細(xì)胞比生長(zhǎng)速率可維持不變。細(xì)胞很少受到培養(yǎng)環(huán)境變化帶來的生理影響，特別是生物反應(yīng)器的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺，維持在一個(gè)較低的水平，從而使他們的利用效率提高，有害產(chǎn)物積累有所減少。然而在高的稀釋率下，雖然死細(xì)胞和細(xì)胞碎片及時(shí)清除，細(xì)胞活性高最終細(xì)胞密度得到提高；可是產(chǎn)物卻不斷在稀釋，因而產(chǎn)物濃度并為提高；尤其是細(xì)胞和產(chǎn)物不斷的稀釋，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率、細(xì)胞增長(zhǎng)速率和產(chǎn)物生產(chǎn)速率低下。

3.連續(xù)式培養(yǎng)不足：
●由于是開放式操作，加上培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，容易造成污染；
●在長(zhǎng)周期的連續(xù)培養(yǎng)中，細(xì)胞的生長(zhǎng)特性以及分泌產(chǎn)物容易變異；
●對(duì)設(shè)備、儀器的控制技術(shù)要求較高。
連續(xù)式培養(yǎng)操作使用的反應(yīng)器多數(shù)是攪拌式生物反應(yīng)器，也可以是管式反應(yīng)器。

4.連續(xù)式培養(yǎng)的特點(diǎn)：
●細(xì)胞維持持續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)；
●產(chǎn)物體積不斷增長(zhǎng)；
●可控制衰退期與下降期。

五、灌流式培養(yǎng)（perfusion culture）

1.灌流式培養(yǎng)是把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。它與半連續(xù)式操作的不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時(shí)，絕大部分細(xì)胞均保留在反應(yīng)器內(nèi)，而半連續(xù)培養(yǎng)在取培養(yǎng)物時(shí)同時(shí)也取出了部分細(xì)胞。

灌流式培養(yǎng)常使用的生物反應(yīng)器主要有兩種形式。一種是用攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，這種反應(yīng)器必須具有細(xì)胞截流裝置，細(xì)胞截留系統(tǒng)開始多采用微孔膜過濾或旋轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，最近開發(fā)的有各種形式的沉降系統(tǒng)或透析系統(tǒng)。

中空纖維生物反應(yīng)器是連續(xù)灌流操作常用的一種。它采用的中空纖維半透膜，透過小分子量的產(chǎn)物和底物，截流細(xì)胞和分子量較大的產(chǎn)物，在連續(xù)灌流過程中將絕大部分細(xì)胞截留在反應(yīng)器內(nèi)；近年來中空纖維生物反應(yīng)器被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)物分泌性動(dòng)物細(xì)胞的生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。

另外一種形式是固定床或流化床生物反應(yīng)器，固定床是在反應(yīng)器中裝配固定的籃筐，中間裝填聚脂纖維載體，細(xì)胞可附著在載體上生長(zhǎng)，也可固定在載體纖維之間，靠上攪拌中產(chǎn)生的負(fù)壓，迫使培養(yǎng)基不斷流經(jīng)填料，有利于營(yíng)養(yǎng)成分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度較大，細(xì)胞在載體中高密度生長(zhǎng)。流化床生物反應(yīng)器是通過流體的上升運(yùn)動(dòng)使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)進(jìn)行反應(yīng)，適合于固定化細(xì)胞的培養(yǎng)。

2.灌流式培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：
●細(xì)胞截流系統(tǒng)可使細(xì)胞或酶保留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高的細(xì)胞密度，一般可達(dá)107-109/ml，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量；
●連續(xù)灌流系統(tǒng)，使細(xì)胞穩(wěn)定的處在較好的的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低；
●反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，可提高生產(chǎn)率，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高；
●產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間短，可及時(shí)回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。

連續(xù)灌注培養(yǎng)是近年用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)分泌型重組治療性藥物和嵌合抗體及人源化抗體等基因工程抗體較為推崇的一種方式。應(yīng)用連續(xù)灌流工藝的公司有Genzyme, Genetic Institute, Bayer公司等。這種方法的困難是污染機(jī)率較高，長(zhǎng)期培養(yǎng)中細(xì)胞分泌產(chǎn)品的穩(wěn)定性，規(guī)模放大過程中工程問題。

六、細(xì)胞工廠培養(yǎng) 細(xì)胞工廠(cell factory)是一種設(shè)計(jì)精巧的細(xì)胞培養(yǎng)裝置。它在有限的空間內(nèi)利用了培養(yǎng)表面，從而節(jié)省了大量的廠房空間,并可節(jié)省貴重的培養(yǎng)液。更重要的是，它可有效地保證操作的無菌性，從而避免因污染而帶來的原料、勞務(wù)和時(shí)間損失。它是對(duì)傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的革命。

丹麥NUNC公司生產(chǎn)的NUNC細(xì)胞工廠是目前應(yīng)用較多的細(xì)胞工廠系統(tǒng)?？捎糜谌缫呙?、單克隆抗體或生物制藥等工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，特別適合于貼壁細(xì)胞，也可用于懸浮培養(yǎng)，在從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模進(jìn)行放大時(shí)不會(huì)改變細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)條件，可提供1，2，10和40盤的規(guī)格使放大變得簡(jiǎn)單易行，低污染風(fēng)險(xiǎn)，節(jié)省空間，培養(yǎng)表面經(jīng)測(cè)試保證有利于細(xì)胞貼附和生長(zhǎng)。同時(shí)，與NUNC的細(xì)胞工廠操作儀結(jié)合使用，可全面實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的自動(dòng)化，從而大大地減低勞動(dòng)強(qiáng)度和密集度。

這套系統(tǒng)使用很方便，可產(chǎn)生類似塑料培養(yǎng)瓶的效果。由組織培養(yǎng)級(jí)聚笨乙烯制成，使用后可隨意處理。其缺點(diǎn)是：經(jīng)胰酶消化后，很難將細(xì)胞完全洗出。

第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器簡(jiǎn)介

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)能否大規(guī)模工業(yè)化、商業(yè)化，關(guān)鍵在于能否設(shè)計(jì)出合適的生物反應(yīng)器（bioreactor）。由于動(dòng)物細(xì)胞與微生物細(xì)胞有很大差異，傳統(tǒng)的微生物反應(yīng)器顯然不適用于動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。首先必須滿足在低剪切力及良好的混合狀態(tài)下，能夠提供充足的氧以供細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)物的合成。

一、生物反應(yīng)器分類

目前，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器主要包括：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器、塑料袋增殖器、填充床反應(yīng)器、多層板反應(yīng)器、螺旋膜反應(yīng)器、管式螺旋反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器、中空纖維及其它膜式反應(yīng)器、攪拌反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器等。

按其培養(yǎng)細(xì)胞的方式不同，這些反應(yīng)可分為以下三類：

1.懸浮培養(yǎng)用反應(yīng)器：如攪拌反應(yīng)器、中空纖維反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器；

2.貼壁培養(yǎng)用反應(yīng)器：如攪拌反應(yīng)器（微載體培養(yǎng)）、玻璃珠床反應(yīng)器、中空纖維反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器；

3.包埋培養(yǎng)用反應(yīng)器：如流化床反應(yīng)器、固化床反應(yīng)器。

二、攪拌罐生長(zhǎng)反應(yīng)器 這是經(jīng)典、早期就被采用的一種生物反應(yīng)器。此類反應(yīng)器與傳統(tǒng)的微生物生物反應(yīng)器類似，真對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)，采用了不同的攪拌器及通氣方式。通過攪拌器的作用使細(xì)胞和養(yǎng)分在培養(yǎng)液中均勻分布，使養(yǎng)分充分被細(xì)胞利用，并增大氣液接觸面，有利于氧的傳遞?，F(xiàn)已開發(fā)的有：籠式通氣攪拌器、雙層籠式通氣攪拌器、槳式攪拌器、海般式攪拌器等。

三、氣升式生物反應(yīng)器

1979年首次應(yīng)用氣升式生物反應(yīng)器成功的進(jìn)行了動(dòng)物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。氣升式生物反應(yīng)器的話優(yōu)點(diǎn)：
●罐內(nèi)液體流動(dòng)溫和均勻，產(chǎn)生剪切力小，對(duì)細(xì)胞損傷較小；
●可直接噴射空氣供氧，因而氧傳遞率較高；
●液體循環(huán)量大，細(xì)胞和養(yǎng)分都能均勻分布于培養(yǎng)液中；
●結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，利于密封并降低了造價(jià)。

常用的氣升式反應(yīng)器有三種：內(nèi)循環(huán)式氣升式、外循環(huán)式氣升式、內(nèi)外循環(huán)式氣升式生物反應(yīng)器。

四、鼓泡式生物反應(yīng)器

與氣升式反應(yīng)器相類似，是利用氣體鼓泡來進(jìn)行供氧及混合，其設(shè)計(jì)原理與氣升式生物反應(yīng)器也相同。

五、中空纖維生物反應(yīng)器 用途較廣，既可用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。其原理是：模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的三維狀態(tài)，利用反應(yīng)器內(nèi)數(shù)千根中空纖維的縱向布置，提供細(xì)胞近似生理?xiàng)l件的體外生長(zhǎng)微環(huán)境，使細(xì)胞不斷生長(zhǎng)。中空纖維是一種細(xì)微的管狀結(jié)構(gòu)，管壁為極薄的半透膜，富含毛細(xì)管，培養(yǎng)時(shí)纖維管內(nèi)灌流充以氧氣的無血清培養(yǎng)液，管外壁則供細(xì)胞黏附生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過半透膜從管內(nèi)滲透出來供細(xì)胞生長(zhǎng)；對(duì)于血清等大分子營(yíng)養(yǎng)物，劃必須從管外灌入，否則會(huì)被半透膜阻隔不能被細(xì)胞利用；細(xì)胞的代謝廢物也可通過半透膜滲入管內(nèi)，避免了過量代謝物對(duì)細(xì)胞的毒害作用。

優(yōu)點(diǎn)是：
●占地空間少；
●細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞密度可達(dá)109數(shù)量級(jí)；
●生產(chǎn)成本低，且細(xì)胞培養(yǎng)維持時(shí)間長(zhǎng)，適用于長(zhǎng)期分泌的細(xì)胞。

六、生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和放大 設(shè)計(jì)的總體考慮是：
①結(jié)構(gòu)嚴(yán)密，能耐受蒸汽滅菌，采用對(duì)生物催化劑無害和耐蝕材料制作，內(nèi)壁光滑無死角，內(nèi)部附件盡量減少，以維持純種培養(yǎng)需要；
②有良好的氣-液接觸和液-固混和性能和熱量交換性能，使質(zhì)量與熱量傳遞有效地進(jìn)行；
③保證產(chǎn)物質(zhì)量和產(chǎn)量前提下，盡量節(jié)省能源消耗；
④減少泡沫產(chǎn)生，或附有消沫裝置以提高裝料系數(shù)，并有必要可靠的參數(shù)檢測(cè)和控制儀表并能與計(jì)算機(jī)聯(lián)機(jī)。

生物反應(yīng)器的放大一種新的生物技術(shù)產(chǎn)品從實(shí)驗(yàn)室到工業(yè)生產(chǎn)的開發(fā)過程中，會(huì)遇到生物反應(yīng)器的逐級(jí)放大問題，每一級(jí)約放大10～100倍。生物反應(yīng)器的放大，表面看來僅是一個(gè)體積或尺度放大問題，實(shí)際上并不是那么簡(jiǎn)單。

反應(yīng)器放大研究雖已提出了不少方法，但還沒有一種是普遍都能適用的。目前還只能是半理論半經(jīng)驗(yàn)的，即抓住反應(yīng)過程中的少量關(guān)鍵性參數(shù)或現(xiàn)象進(jìn)行放大。

有關(guān)氧傳遞問題在生物反應(yīng)器中，氧的傳遞速率要滿足細(xì)胞對(duì)氧的攝取速率，并使反應(yīng)器中溶解氧的濃度CL要維持在一定水平上。這就是說，在穩(wěn)態(tài)情況下，供氧與需氧間存在下列關(guān)系：KLa(C*-CL)=r

此處， KLa為氧的傳遞系數(shù)；C*為相當(dāng)氣相氧分壓的溶氧濃度，CL為培養(yǎng)液中溶氧濃度，r為攝氧率。

影響供氧的因素從上式可知r=KLa(C*-CL)；因此影響供氧的因素總體上講是KLa和C*-CL值。

要增大C*-CL，無非是增大C*值或降低CL值。增大C*的措施，有適當(dāng)增加反應(yīng)器中操作壓力和增大氣相中的氧分壓兩個(gè)方法。在實(shí)際操作中，反應(yīng)器保持一定正壓，以防止大氣中的雜菌從軸封、閥門等處侵入，但在增加罐壓的同時(shí)，發(fā)酵代謝所產(chǎn)生的CO2也會(huì)更多地溶解于培養(yǎng)液而對(duì)發(fā)酵不利。至于CL值，一般不允許過分減小，因?yàn)榧?xì)胞在生長(zhǎng)中有一個(gè)臨界氧濃度，低于此臨界值，細(xì)胞的呼吸將受到抑制。

影響KLa的因素大致可分為三個(gè)方面：一是反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)，包括相對(duì)幾何尺寸的比例；二是操作條件，如攪拌功率或循環(huán)泵功率的輸入量，通氣量等；三是培養(yǎng)或發(fā)酵液的物理化學(xué)性質(zhì)，如流變特性，特別是其粘度或顯示粘度、表面張力、擴(kuò)散系數(shù)、細(xì)胞形態(tài)、泡沫程度等。

生物反應(yīng)器中的傳熱在細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵過程中，熱量的釋放是普遍存在的。這是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)或發(fā)酵過程中細(xì)胞與周圍環(huán)境的物質(zhì)產(chǎn)生新陳代謝，即發(fā)生異化（分解）作用和同化（合成）作用，而異化作用一般釋放能量，同化作用則是吸收能量。同化作用包括細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖、產(chǎn)物形成所需能量來自細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基中的基質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分的異化。從熱力學(xué)角度講，異化所產(chǎn)生能量必然應(yīng)多于同化所需要能量，而多余的能量則轉(zhuǎn)化為熱能釋放到周圍環(huán)境中去。無論是涉及細(xì)胞或酶的反應(yīng)中，釋放出的熱量都應(yīng)及時(shí)移去，以免影響過程的正常進(jìn)行，為此在生物反應(yīng)器中一般都附有冷卻裝置。

第五節(jié) 微載體培養(yǎng)技術(shù)（microcarrier culture technique）

一、微載體培養(yǎng)應(yīng)用 此技術(shù)于1967年被用于動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)。經(jīng)過三十余年的發(fā)展，該技術(shù)目前已漸日趨完善和成熟，并廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)疫苗、基因工程產(chǎn)品等。微載體培養(yǎng)是目前公認(rèn)的有發(fā)展前途的一種動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，放大容易。目前微載體培養(yǎng)廣泛用于培養(yǎng)各種類型細(xì)胞，生產(chǎn)疫苗、蛋白質(zhì)產(chǎn)品，如293細(xì)胞、成肌細(xì)胞、Vero細(xì)胞、CHO細(xì)胞。

使用較多的反應(yīng)器有兩種：貝朗公司的BIOSTAT?B反應(yīng)器，使用雙槳葉無氣泡通氣攪拌系統(tǒng)；NBS公司的CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反應(yīng)器，使用Cell-lift雙篩網(wǎng)攪拌系統(tǒng)。兩種系統(tǒng)都能實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)細(xì)胞和收獲產(chǎn)物的有效分離。

二、微載體 是指直徑在60-250μm，能適用于貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。自Van Wezel用DEAE-Sephadex A 50 研制的第一種微載體問世以來，國(guó)際市場(chǎng)上出售的微載體商品的類型已經(jīng)達(dá)十幾種以上，包括液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。常用商品化微載體有三種：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。

●微載體的大?。涸龃髥挝惑w積內(nèi)表面積（S/F）對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)非常有利。使微載體直徑盡可能小，最好控制在100-200μm之間。
●微載體的密度：一般為1.03-1.05g/cm2，隨著細(xì)胞的貼附及生長(zhǎng)，密度可逐漸增大。
●微載體的表面電荷：據(jù)研究，控制細(xì)胞貼壁的基本因素是電荷密度而不是電荷性質(zhì)。若電荷密度太低，細(xì)胞貼附不充分，但電荷密度過大，反而會(huì)產(chǎn)生“毒性”效應(yīng)。

三、微載體培養(yǎng)原理與操作

1.原理：其原理是將對(duì)細(xì)胞無害的顆粒-微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長(zhǎng)，同時(shí)通過持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。

貼壁依賴性細(xì)胞在微載體表面上的增殖，要經(jīng)歷黏附貼壁、生長(zhǎng)和擴(kuò)展成單層三個(gè)階段。細(xì)胞只有貼附在固體基質(zhì)表面才能增殖，故細(xì)胞在微載體表面的貼附是進(jìn)一步鋪展和生長(zhǎng)的關(guān)鍵。黏附主要是靠靜電引力和范德華力。細(xì)胞能否在微載體表面黏附，主要取決于細(xì)胞與微載體的接觸概率和相融性。

2. 攪拌轉(zhuǎn)速：由于動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，對(duì)剪切力敏感，因而無法靠提高攪拌轉(zhuǎn)速來增加接觸概率。通常的操作方式是：在貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速，時(shí)攪時(shí)停；數(shù)小時(shí)后，待細(xì)胞附著于微載體表面時(shí)，維持設(shè)定的低轉(zhuǎn)速，進(jìn)入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，最大速度75r/min。

3.細(xì)胞與微載體的相融性，是與微載體表面理化性質(zhì)有關(guān)。一般細(xì)胞在進(jìn)入生理PH值時(shí)，表面帶負(fù)電荷。若微載體帶正電荷，則利用靜電引力可加快細(xì)胞貼壁速度。若微載體帶負(fù)電荷，因靜電斥力使細(xì)胞難于黏附貼壁，但培養(yǎng)液中溶有或微載體表面吸附著二價(jià)陽離子作為媒介時(shí)，則帶負(fù)電荷的細(xì)胞也能貼附。

4. 細(xì)胞在微載體表面的生長(zhǎng) 影響細(xì)胞在微載體表面生長(zhǎng)的因素很多，主要有三個(gè)方面。

●在細(xì)胞方面，如細(xì)胞群體、狀態(tài)和類型。
●在微載體方面，如微載體表面狀態(tài)、吸附的大分子和離子；微載體表面光滑時(shí)細(xì)胞擴(kuò)展快，表面多孔則擴(kuò)展慢。
●在培養(yǎng)環(huán)境中，如培養(yǎng)基組成、溫度、pH、DC以及代謝廢物等均明顯影響細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)。如果所處條件合適，則細(xì)胞生長(zhǎng)快；反之生長(zhǎng)速度慢。

5. 微載體培養(yǎng)操作要點(diǎn)

●培養(yǎng)初期：保證培養(yǎng)基與微球體處于穩(wěn)定的PH與溫度水平，接種細(xì)胞（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而非穩(wěn)定期）至終體積1/3的培養(yǎng)液中，以增加細(xì)胞與微載體接觸的機(jī)會(huì)。不同的微載體所用濃度及接種細(xì)胞密度是不同的。常使用2-3g/L的微載體含量，更高的微載體濃度需要控制環(huán)境或經(jīng)常換液。
●貼壁階段（3-8d）后，緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，并且增加攪拌速度保證完全均質(zhì)混合。
●培養(yǎng)維持期：進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（胞核計(jì)數(shù)）、葡萄糖測(cè)定及細(xì)胞形態(tài)鏡檢。隨意細(xì)胞增殖，微球變得越來越重，需增加攪拌速率。經(jīng)過3d左右，培養(yǎng)液開始呈酸性，需換液：停止攪拌，讓微珠沉淀5min，棄掉適宜體積的培養(yǎng)液，緩慢加入新鮮培養(yǎng)液（37℃），重新開始攪拌。
●收獲細(xì)胞：首先排干培養(yǎng)液，至少用緩沖液漂洗1遍，然后加入相應(yīng)的酶，快速攪拌（75-125r/min）20-30min。然后解離收集細(xì)胞及其產(chǎn)品。
●微載體培養(yǎng)的放大：可以通過增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進(jìn)行放大。使用異倍體或原代細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗、干擾素，已被放大至4000L以上。

四、微載體大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng) 此技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)，細(xì)胞擴(kuò)增的效率受到諸多因素的影響和限制，其中主要的限制性因素包括：細(xì)胞對(duì)剪切力的敏感性、氧的傳遞以及傳代和擴(kuò)大培養(yǎng)等。而研制的各種類型生物反應(yīng)器系統(tǒng)則可針對(duì)上述限制性因素，為微載體細(xì)胞培養(yǎng)與擴(kuò)增提供低剪切力、高氧傳遞效率、易于細(xì)胞傳代等適宜的外部環(huán)境。已較多使用的微載體培養(yǎng)系統(tǒng)生物反應(yīng)器，可以實(shí)行計(jì)算機(jī)控制操作，培養(yǎng)攪拌速度及懸浮均勻程度、溫度變化、PH穩(wěn)定及溶氧供應(yīng)（O2、N2、CO2、空氣四種純化氣體按比例調(diào)節(jié)）、罐壓、培養(yǎng)體積和通氣量等參數(shù)全部由電腦自動(dòng)控制。因此，應(yīng)用生物反應(yīng)器系統(tǒng)進(jìn)行微載體細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增具有明顯優(yōu)勢(shì)，目前國(guó)外相繼研制了數(shù)種適合進(jìn)行微載體大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，如攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)、旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器系統(tǒng)以及灌注式生物反應(yīng)器系統(tǒng)等。

1、攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng) 攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)在微載體細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增研究領(lǐng)域已有較長(zhǎng)的研究歷史，但因該細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)容易產(chǎn)生過大的剪切力，從而限制了其應(yīng)用范圍。盡管如此，由于該系統(tǒng)具有簡(jiǎn)單、實(shí)用及價(jià)格低廉等特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外仍有不少應(yīng)用該系統(tǒng)成功進(jìn)行細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增的研究報(bào)道。例如，Werner A（2000年）成功地在該系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行了肝細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增的研究。

2、灌注式生物反應(yīng)器系統(tǒng) 灌流培養(yǎng)是目前研究熱點(diǎn)之一。它的特點(diǎn)是不斷地加入新鮮培養(yǎng)基以及不斷地抽走含細(xì)胞代謝廢物的消耗培養(yǎng)基，使細(xì)胞得以在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境內(nèi)增殖，即省時(shí)省力，又減少了細(xì)胞發(fā)生污染的機(jī)會(huì)，且可以提高細(xì)胞密度10倍以上。

3、旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器 近年來，旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器系統(tǒng)（RCCS）已經(jīng)成為應(yīng)用微載體技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增的一種較常用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)是基于美國(guó)航空航天局為模擬空間微重力效應(yīng)而設(shè)計(jì)的一種生物反應(yīng)器。RCCS既可以用于微載體大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，又能在其內(nèi)培育細(xì)胞與支架形成的三維空間復(fù)合體。至今，近百種組織細(xì)胞均在該系統(tǒng)內(nèi)成功進(jìn)行了大規(guī)模擴(kuò)增。

五、微載體培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)

●表面積/體積（S/V）大，因此單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高；
●把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)；
●可用簡(jiǎn)單的顯微鏡觀察細(xì)胞在微珠表面的生長(zhǎng)情況；
●簡(jiǎn)化了細(xì)胞生長(zhǎng)各種環(huán)境因素的檢測(cè)和控制，重現(xiàn)性好；
●培養(yǎng)基利用率較高；
●放大容易；
●細(xì)胞收獲過程不復(fù)雜；
●勞動(dòng)強(qiáng)度??；
●培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積和空間小。